抗體是生物學(xué)科研工作中最有力的工具，沒(méi)有之一。這些“精確制導(dǎo)武器”，會(huì)在研究中主動(dòng)尋找并結(jié)合研究者感興趣的目標(biāo)，并可通過(guò)各種示蹤技術(shù)將目標(biāo)展現(xiàn)出來(lái)。正是由于抗體的專一特性，研究者可能會(huì)依賴于示蹤實(shí)驗(yàn)所顯示的結(jié)果對(duì)所研靶標(biāo)給出定性或定量的判斷。也正因此，毫無(wú)疑問(wèn)的，專一性或特異性是抗體最受科研工作者關(guān)注的特性。那么，抗體特異性主要由什么決定？為什么常聽(tīng)到多抗特異性不如單抗的說(shuō)法？在實(shí)驗(yàn)中，是該選擇單抗還是多抗？
下面我們將就抗體的生產(chǎn)制備過(guò)程分析抗體特異性差異的原因。
抗體的制備，無(wú)論是單抗還是多抗，其前期的動(dòng)物免疫步驟是完全相同的，差異僅僅在篩選。或者說(shuō)，單抗是在多抗制備的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步篩選并穩(wěn)定表達(dá)特異單克隆細(xì)胞株的結(jié)果。當(dāng)抗原免疫動(dòng)物后，在淋巴結(jié)和脾等淋巴器官內(nèi)通過(guò)一系列抗原處理和遞呈，促使B淋巴漿母細(xì)胞（Plasmablasts, PBs）分化成熟，在轉(zhuǎn)錄水平成為分泌特異抗體的B淋巴漿細(xì)胞（Plasma cells, PCs），大量不同的漿細(xì)胞會(huì)分泌不同的針對(duì)抗原的抗體。由此，可以說(shuō)每一個(gè)B漿細(xì)胞都成為一株單克隆抗體的候選者。
傳統(tǒng)的單克隆抗體制備就是通過(guò)將小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系融合，篩選能夠分泌特異抗體并穩(wěn)定傳代的融合細(xì)胞株而實(shí)現(xiàn)的。而多克隆抗體（多抗）的制備就是從血清中分離純化所有的未經(jīng)篩選的單克隆抗體。從以上過(guò)程可以看出，無(wú)論是單抗還是多抗制備方法，其針對(duì)靶點(diǎn)（抗原）的特異性抗體的產(chǎn)生主要源于被免疫動(dòng)物自身的漿細(xì)胞分化成熟，抗體生產(chǎn)者（人）其實(shí)并沒(méi)有做什么。
不同在于，多克隆抗體猶如許多單克隆抗體的集合，它們有的特異性高，有的特異性低，總體特異性符合正態(tài)分布曲線的形式（如Fig1），而其特異性的總體表現(xiàn)也應(yīng)處于統(tǒng)計(jì)學(xué)正態(tài)曲線中位線（MID）的水平。而單抗制備后續(xù)的篩選過(guò)程，可去除大部分的非特異抗體，保留幾株特異性較好的單克隆抗體。
Fig1.單抗與多抗特異性示意圖
然而，單抗制備過(guò)程中的細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)發(fā)生的過(guò)程，動(dòng)物脾臟內(nèi)的各種細(xì)胞如內(nèi)皮、平滑肌、巨噬、NK、T、還有紅細(xì)胞、血小板等都可能與骨髓瘤細(xì)胞系發(fā)生融合。盡管B細(xì)胞是脾臟內(nèi)主要的淋巴細(xì)胞，但能夠分泌特異性抗體的成熟漿細(xì)胞占脾細(xì)胞的比例很低，加之促細(xì)胞融合試劑如PEG等的細(xì)胞毒性，使得最終成功融合形成穩(wěn)定表達(dá)特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞系的效率極低，大約為10-6。因此，在單抗制備過(guò)程中，大部分分泌特異性抗體的B細(xì)胞可能都被損失了。最終獲得的單克隆抗體其親和力和特異性可能都不是本次免疫中最好的。
Fig2. 單克隆抗體制備流程
假如把每個(gè)漿細(xì)胞比作一個(gè)士兵，人就是指揮官，指令新兵們訓(xùn)練打靶。打靶的次數(shù)（免疫次數(shù)）增多后，會(huì)有越來(lái)越多的新兵變成神槍手。指揮官將好的神槍手挑出來(lái)，培養(yǎng)成一個(gè)一個(gè)的“狙擊手”（單克隆抗體）。然而，狙擊手的選拔機(jī)制卻是簡(jiǎn)單粗暴的，且與狙擊能力無(wú)關(guān)，比如能否舉起200 kg的杠鈴，這可能將真正優(yōu)秀的狙擊手淘汰掉了。而多抗就像一個(gè)經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的老兵連隊(duì)，既有槍法平庸的兵，同時(shí)也擁有優(yōu)秀的狙擊手。
生物樣本的成分通常非常復(fù)雜。雜帶或高背景通常是由于多克隆抗體中有的抗體克隆非特異地結(jié)合復(fù)雜樣本造成的。如前所述，多抗所表現(xiàn)的特異性是多個(gè)抗體克隆的中位線水平。所以從特異性上講，多抗通常不如單抗。多抗特異性可通過(guò)生產(chǎn)環(huán)節(jié)比如使用高純度的免疫原，以及使用提純的靶點(diǎn)蛋白對(duì)多抗進(jìn)行免疫親和層析純化等方法得以改進(jìn)。經(jīng)過(guò)免疫親和層析的多抗其總體特異性將大大提升，與單抗相比已相差無(wú)幾。
另一方面，不同生產(chǎn)廠商制備多抗的原理方法基本相同，然而在抗原設(shè)計(jì)及制備上千差萬(wàn)別。如使用全長(zhǎng)蛋白，則蛋白的表達(dá)純化，如使用多肽，則多肽的位置選擇，不同廠商都有各自的策略，這也使得針對(duì)同一靶點(diǎn)的多抗特異性相差較大。在研究者的交流過(guò)程中也留下“多抗特異性差”的印象。因而，如果使用多抗檢測(cè)，推薦更有經(jīng)驗(yàn)、口碑更好的生產(chǎn)廠商。
一般而言，單克隆抗體的確具有更高的特異性，但這個(gè)特異性是指針對(duì)抗原上一個(gè)表位（epitope）或抗原決定簇（determinant）的特異性，而不是指針對(duì)整個(gè)靶點(diǎn)蛋白的特異性。根據(jù)抗體最核心的表位結(jié)合區(qū)域—互補(bǔ)決定區(qū)（Complementarity Determining Region，CDR）的結(jié)構(gòu)，抗體通?？梢跃o密結(jié)合的抗原表面區(qū)域或表位面積很?。?lt;5 nm），對(duì)于變性的肽段約在4-8個(gè)Aa以內(nèi)，以及5-7個(gè)單糖的糖鏈或6-8個(gè)核苷酸的核酸。通過(guò)肽段BLAST可以得知，小肽段序列完全相同的情況將在很多不同蛋白上發(fā)生。這意味著單抗識(shí)別的這個(gè)表位可能并不僅僅屬于靶標(biāo)蛋白本身，也即意味著，即使利用純化抗原蛋白進(jìn)行了特異性篩選的單克隆抗體，當(dāng)用其檢測(cè)復(fù)雜樣本時(shí)，也將面臨交叉反應(yīng)或假陽(yáng)性問(wèn)題。這仍須以不同的檢測(cè)手段比如基因敲除等對(duì)結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)。
Fig3. IgG分子結(jié)構(gòu)
當(dāng)我們計(jì)劃利用抗體去抓出感興趣的靶點(diǎn)時(shí)，需要考慮抗體的特異性和敏感性兩個(gè)因素。特異性決定了假陽(yáng)性結(jié)果的多少，敏感性決定了檢出率的高低。在復(fù)雜樣本中，由于多克隆抗體識(shí)別抗原的多個(gè)表位，可以在一個(gè)抗原分子上結(jié)合更多的抗體分子，也可以在當(dāng)部分抗原表位受到一定程度的遮蓋或破壞時(shí)，仍有抗體結(jié)合在未受影響的表位上。這種情況常發(fā)生在如石蠟包埋的免疫組化（IHC-P）等實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)樣本經(jīng)甲醛交聯(lián)固定后，即使經(jīng)過(guò)抗原修復(fù)，抗原表位也不可避免地受到了影響，此時(shí)單克隆抗體由于只識(shí)別一個(gè)表位，結(jié)合能力可能大大降低甚至呈現(xiàn)陰性結(jié)果，而只要不是所有表位都受到了破壞，多抗仍可以獲得該靶點(diǎn)的陽(yáng)性結(jié)果。同樣的，對(duì)于樣本中一些表達(dá)豐度極低的蛋白，由于多表位結(jié)合更多抗體分子，檢測(cè)信號(hào)就將被放大，因此，使用多抗具有靈敏度和檢出率上的優(yōu)勢(shì)。
小結(jié)
單克隆與多克隆抗體差異總結(jié)
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單克隆抗體 |
多克隆抗體 |
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制備周期 |
長(zhǎng)（5-6個(gè)月） |
短（2-3個(gè)月） |
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技術(shù)要求 |
高 |
低 |
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產(chǎn)量 |
高 |
低 |
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價(jià)格 |
高 |
低 |
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對(duì)免疫原要求 |
較高 |
高 |
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特異性 |
高 |
高（抗原親和純化） |
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識(shí)別表位 |
一個(gè) |
多個(gè) |
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非特異結(jié)合 |
較少 |
較多 |
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靈敏度 |
較高 |
高 |
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標(biāo)準(zhǔn)化 |
易，批間差小 |
較難，批間差大 |
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穩(wěn)定性 |
較好 |
好 |
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凝集反應(yīng) |
大多數(shù)沒(méi)有 |
有 |
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沉淀反應(yīng) |
大多數(shù)沒(méi)有 |
有 |
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中和活性 |
大多數(shù)沒(méi)有 |
有 |
為減少多克隆抗體制備中的批間差，生產(chǎn)環(huán)節(jié)需要更加嚴(yán)格控制，每批次免疫動(dòng)物的數(shù)量至少三只，以降低動(dòng)物個(gè)體差異影響。動(dòng)物的來(lái)源、種系、性別、周齡、體重、飼喂環(huán)境、免疫原及免疫流程（SOP）等也嚴(yán)格保持一致，這樣可以有效控制多抗生產(chǎn)時(shí)的批間差。
總之，在不同實(shí)驗(yàn)中善用“狙擊手”和“老兵連隊(duì)”，可以更加高效地獲得所需的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
