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發(fā)表者：北京博奧森生物      發(fā)表時(shí)間：2019-3-25

要想成為流式細(xì)胞術(shù)大神

既要了解流式細(xì)胞術(shù)的原理

又要懂得熒光素的選擇

最重要的是

讀 懂 流 式 圖！

流式圖有單參數(shù)直方圖、二維散點(diǎn)圖、二維等高線圖與密度圖，三維圖以及假三維圖，其中最常用的是二維散點(diǎn)圖和單參數(shù)直方圖。本文主要對二維散點(diǎn)圖、單參數(shù)直方圖及一些常見問題進(jìn)行介紹。

1.二維散點(diǎn)圖

二維散點(diǎn)圖能夠表示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對數(shù)之間的關(guān)系，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)分別代表與細(xì)胞有關(guān)的兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)，平面上每一個(gè)點(diǎn)表示具有相應(yīng)坐標(biāo)值的細(xì)胞。散點(diǎn)圖是一種雙變量描述，可被分為四象限，至少產(chǎn)生四種可能的結(jié)果來明確區(qū)分陰性和陽性。其結(jié)果用整個(gè)散點(diǎn)圖中出現(xiàn)的特定象限的細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分率表示，每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)單獨(dú)事件。這四個(gè)象限分別用LL，UL，UR，LR表示。

圖1：CD4/FITC(BF00201)、CD8/APC-Cy7（BF00321）雙染

看圖技巧：

LL（左下）：表示對于X軸所代表的參數(shù)呈陰性，對于Y軸所代表的參數(shù)呈陰性反應(yīng)的細(xì)胞，如圖表示CD8、CD4雙陰性細(xì)胞。

UL（左上）：表示對于Y軸所代表的的參數(shù)呈陽性，對于X軸所代表的參數(shù)呈陰性反應(yīng)的細(xì)胞，如圖表示CD8+、CD4-細(xì)胞。

UR（右上）：表示對于X軸、Y軸所代表的參數(shù)呈雙陽性的細(xì)胞，如圖表示CD8+、CD4+雙陽性細(xì)胞。

LR（右下）：表示對于X軸所代表的參數(shù)呈陽性反應(yīng)，而對Y軸所代表的參數(shù)呈陰性反應(yīng)的細(xì)胞，如圖表示CD8-、CD4+細(xì)胞。

大神支招：必須先了解X軸、Y軸各自所代表參數(shù)的意義；再看四個(gè)象限，并了解各象限意義；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)，檢測目的物一般用各象限區(qū)內(nèi)的細(xì)胞數(shù)占門內(nèi)細(xì)胞數(shù)百分比或平均熒光強(qiáng)度表示 。

2.單參數(shù)直方圖

單參數(shù)直方圖是一維數(shù)據(jù)用的最多的圖形顯示形式，即可用于定性分析，又可用于定量分析。每一個(gè)細(xì)胞單參數(shù)的測量數(shù)據(jù)可以整理成統(tǒng)計(jì)分布，以直方圖的方式來顯示。在圖中，橫坐標(biāo)表示熒光信號(hào)或散射光信號(hào)相對強(qiáng)度的值，其單位是道數(shù)（channel），可以是線形（line）或者對數(shù)（log）。縱坐標(biāo)一般是相對細(xì)胞/粒子數(shù)（count）。利用直方圖來設(shè)門分析，可得到細(xì)胞數(shù)目（events）、門內(nèi)細(xì)胞百分比（%gated）、平均熒光強(qiáng)度（mean）、中位數(shù)（median）等統(tǒng)計(jì)參量，總的來說單參數(shù)直方圖只能表示具有同一特征細(xì)胞的數(shù)量及其熒光強(qiáng)度。

圖2：左為細(xì)胞周期（BA00205）分析；右為CD4/FITC(BF00201)表達(dá)情況

看圖技巧：先看橫縱坐標(biāo)了解檢測目的，縱坐標(biāo)代表細(xì)胞數(shù)(如圖細(xì)胞周期分析（BA00205）；G1表示細(xì)胞進(jìn)行大量遺傳物質(zhì)合成的時(shí)期，G2表示DNA復(fù)制結(jié)束和開始有絲分裂之間的間隙，圖右為CD4/FITC(BF00201)的蛋白表達(dá)情況)；看圖形分布，直方圖峰型越往右移，代表其熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。（右圖中M2區(qū)域細(xì)胞的熒光強(qiáng)度要高于M1區(qū)域細(xì)胞的熒光強(qiáng)度）；M1的確定是根據(jù)陰性對照細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光閾值設(shè)定的，峰型右移熒光信號(hào)大于基礎(chǔ)熒光閾值M1，表示陽性M2。

Q&A

Q1:流式圖中的顏色與熒光顏色是否一致?

A：與熒光顏色無關(guān)，流式圖中的顏色為人為指定。

Q2：流式圖中的陰/陽（N/P）如何劃分?

A：實(shí)際上這個(gè)M1的劃分完全是根據(jù)陰性(同型)對照來的，即使用同型抗體進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，反映待測標(biāo)本對抗體非特異性結(jié)合的水平，以幫助省去繁瑣的競爭封閉步驟。右圖即陽性組，也就是接受刺激后的蛋白表達(dá)情況。

Q3: 這么巧，陰性正好在10¹劃分？

A：其實(shí)我們可以人為地將電壓、放大倍數(shù)調(diào)到相應(yīng)的大小，使陰性的右邊界在某一個(gè)值上，（通常劃在10¹附近）這樣后期做sample時(shí)好看，當(dāng)然也可以調(diào)到10²，10³次方。

Q4：為什么要進(jìn)行熒光補(bǔ)償？

A：流式細(xì)胞分析中經(jīng)常要用到2種以上的熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行染色，而目前所使用的多種熒光染料發(fā)射譜間有一定重疊?！盁晒庋a(bǔ)償”這個(gè)術(shù)語是指修正熒光滲漏的過程，如從探測器除去匹配熒光以外的任何熒光信號(hào)。

Bioss 流式細(xì)胞技術(shù)服務(wù)

本服務(wù)項(xiàng)目是利用流式細(xì)胞儀和熒光標(biāo)記抗體對客戶提供的細(xì)胞樣品或全血樣品進(jìn)行檢測分析。

可檢測項(xiàng)目：

1、細(xì)胞周期檢測：包括細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞周期同步化，細(xì)胞進(jìn)行加藥處理，細(xì)胞收集乙醇固定，PI染色上機(jī)樣本制備，流式上機(jī)檢測，數(shù)據(jù)分析。

2、細(xì)胞凋亡檢測：包括細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞進(jìn)行加藥誘導(dǎo)處理，細(xì)胞收集樣本制備，流式上機(jī)檢測，數(shù)據(jù)分析。

3、免疫細(xì)胞分型：包括細(xì)胞收集樣本制備，流式上機(jī)檢測，數(shù)據(jù)分析。

4、細(xì)胞表面抗原鑒定：包括細(xì)胞收集樣本制備，流式上機(jī)檢測，數(shù)據(jù)分析。

5、同城上機(jī)檢測：由客戶制備好樣本，流式上機(jī)檢測，數(shù)據(jù)分析。

服務(wù)編號(hào)	服務(wù)項(xiàng)目	實(shí)驗(yàn)周期
SV1401	細(xì)胞周期檢測	3-5天
SV1402	細(xì)胞凋亡檢測	3-5天
SV1403	免疫細(xì)胞分型	2-3天
SV1404	表面抗原鑒定	2-3天
SV1405	同城上機(jī)檢測	1-2天

Bioss 檢測案例

八色小鼠脾臟免疫表型分析

1）在FSC/SSC圖上，設(shè)門P1圈出淋巴細(xì)胞；基于淋巴細(xì)胞在FSC-H/FSC-A圖上設(shè)門E2圈出單個(gè)細(xì)胞排除粘連體；基于E2在7-AAD/SSC圖上設(shè)門R3圈出7-AAD陰性的活細(xì)胞。

2）基于R3門，在CD3/CD19圖上設(shè)十字門，CD3+CD19-為T細(xì)胞，CD3-CD19+為B細(xì)胞。

3）基于R3門，在CD3/NK1.1圖上設(shè)十字門，CD3-NK1.1+為NK細(xì)胞，CD3+NK1.1+為NKT細(xì)胞。

4）基于CD3+T細(xì)胞，在CD4/CD8a上設(shè)十字門，CD4+CD8-為輔助性T細(xì)胞，CD4-CD8+為細(xì)胞毒性T細(xì)胞。

5）基于CD3+T細(xì)胞，在CD8a/CD103和CD25/CD4圖上分析CD103、CD25的表達(dá)情況。

圖3：八色小鼠脾臟免疫表型分析

經(jīng)典雙激光六色熒光搭配方案