免疫熒光技術(shù)簡(jiǎn)介
免疫熒光技術(shù)是基于熒光基團(tuán)被特定波長(zhǎng)的光激發(fā)后發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光的特性，通過(guò)熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等儀器的檢測(cè)，達(dá)到定位、示蹤、含量測(cè)定等目的，并廣泛應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域。熒光染料可以與一抗或二抗直接偶聯(lián)，也可與鏈霉素親和素偶聯(lián)。主要特點(diǎn)：特異性強(qiáng)，敏感度高，速度快，可進(jìn)行亞細(xì)胞定位的精細(xì)觀察，可以一次檢測(cè)多種抗原。
免疫熒光工作原理
樣本的制備
熒光抗體技術(shù)主要依靠觀察切片標(biāo)本上熒光抗體的染色結(jié)果作為抗原的鑒定，因此標(biāo)本制作的好壞直接影響檢測(cè)的結(jié)果；在制作標(biāo)本過(guò)程中應(yīng)力求保持抗原的完整性，并在染色、洗滌和包埋過(guò)程中不發(fā)生溶解和變性，也不擴(kuò)散至臨近細(xì)胞或組織間隙中去；標(biāo)本切片要盡量薄，以利于抗原抗體接觸和鏡檢。
石蠟切片與冰凍切片的對(duì)比
冰凍切片制備要點(diǎn)
冰凍切片的質(zhì)量與實(shí)驗(yàn)成敗息息相關(guān)，高質(zhì)量的切片可以避免實(shí)驗(yàn)中組織脫片，減少組織細(xì)胞形態(tài)的損壞，大大提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。我們要從實(shí)驗(yàn)取材開(kāi)始就做正確的處理方式，盡量減少人為因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的不確定性。
1.選取組織
盡量使用新鮮取材的組織，以使抗原較好的保存下來(lái)，降低凍存幾率從而減少組織內(nèi)冰晶的產(chǎn)生；離體組織最好直接進(jìn)行切片，將組織放在樣品托上，滴加OCT包埋劑，選擇合適的溫度在冰凍切片機(jī)中冷凍30min以上，具體時(shí)間根據(jù)組織大小而定，要保證組織冷凍均勻，不宜時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，組織會(huì)因過(guò)度冷凍開(kāi)裂而導(dǎo)致切片失敗。
2.制片及常見(jiàn)問(wèn)題
不同組織所需切片溫度不同，要選擇最適溫度才能獲得高質(zhì)量的冰凍切片。冷凍溫度通常在-10℃至-25℃左右，所需溫度：心、腎、胃、腸＜腦、脾、肌肉。
切片時(shí)一定要保持勻速，切片要平整不能皺縮，其厚度通常為7μm。粘片時(shí)應(yīng)平行的將涂有粘片劑的載玻片貼近組織切片，不要從一側(cè)慢慢地將組織切片吸附到載玻片上，這樣會(huì)影響組織細(xì)胞形態(tài)。
3.固定及保存
制備好的切片室溫放置1 h，晾干后-20℃丙酮中固定20min，切片可以在4℃條件下保存一個(gè)月左右，-20℃保存可以適當(dāng)延長(zhǎng)保存時(shí)間；建議盡快使用。
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