又是一年開學季，有的小伙伴剛進入實驗室，要投入忙碌而緊張的科研工作中了吧？
WB... 免疫組化... 免疫熒光...流式細胞...各種技術也是在勤學苦練當中吧？
想學技術何必東奔西走，Bioss科學家早已經把多年秘籍備好，準備傾囊相贈！
我們近期會連續(xù)介紹多種抗體應用技術的標準操作流程和常見問題解決方案，你想要的全都有，持續(xù)關注本公眾號，獲取更多資訊，讓你的實驗做得輕松愉快又標準！
開學季技術大講堂——（一）抗體相關基本知識
抗體(antibody)是生物體在抗原物質刺激下，由B細胞分化成的漿細胞所產生的、可與相應抗原發(fā)生特異性結合反應的免疫球蛋白(Ig)。按抗體的來源，可將其分為天然抗體和人工制備的抗體，是通過對特定生物體免疫接種特定抗原物質后而獲得。人工免疫動物制備的抗體應用甚為廣泛，既可以用于科學研究，也可以用于疾病的預防、診斷和治療。
一、抗體的基本結構
經x線晶體衍射結構分析發(fā)現(xiàn)，抗體Ig由四條多肽鏈組成，各肽鏈之間由數(shù)量不等的鏈間二硫鍵連接。Ig可形成“Y”字型結構，稱為Ig單體，是構成抗體的基本單位。
（一）重鏈和輕鏈
天然Ig分子含有四條異源性多肽鏈，其中，分子量較大的兩條鏈稱為重鏈(heavy chain, H)，而分子量較小的兩條鏈稱為輕鏈(Light chain, L)。同一Ig分子中的兩條H鏈和兩條L鏈的氨基酸組成完全相同。
1. 重鏈分子量為50000～75000，由450～550個氨基酸殘基組成。重鏈恒定區(qū)的氨基酸組成和排列順序不同，其抗原性也不同。據(jù)此，可將抗體Ig分為5類(class)，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE, 其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈，商品化的抗體絕大部分都是IgG。不同類的Ig具有不同的特征，如鏈內和鏈間二硫鍵的數(shù)量和位置、結構域的數(shù)量及鉸鏈區(qū)的長度等均不完全相同。即使是同一類的Ig，其鉸鏈區(qū)氨基酸組成和重鏈二硫鍵的數(shù)量、位置也不同，據(jù)此又可將同類Ig分為不同的亞類(subclass)。
IgG的亞類
利用不同種屬動物制備的IgG存在不同的亞類，常見的不同種屬IgG亞類如下：
? 兔: IgG（無亞類）
? 小鼠: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3
? 大鼠: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgM
? 山羊: IgG1, IgG2
在進行某些抗體相關實驗(如IF和FCM)的時候，我們常常需要仔細看一下所訂購商品化抗體的IgG亞類，以方便我們選擇同型對照(isotype control) IgG (即與目的蛋白抗體相同來源種屬的相同類型正常IgG)作為抗體的陰性對照進行平行實驗，以排除可能的非特異性染色結果。
2. 輕鏈分子量約為25000，由214個氨基酸殘基構成。輕鏈可分為兩種，分別為kappa(κ)鏈和lambda(λ)鏈。據(jù)此，可將lg分為兩型(type)，即κ型和λ型，一個Ig分子上兩條輕鏈的型別總是相同的。生物體內可同時存在κ型和λ型的Ig分子，不同種屬生物體內兩型輕鏈的比例不同。正常人血清Ig的κ: λ約為2:1，而在小鼠則為20:1。根據(jù)λ鏈恒定區(qū)個別氨基酸的差異，又可將λ鏈分為λl、λ2、λ3和λ4四個亞型(subtype)。
（二）可變區(qū)和恒定區(qū)
通過分析不同Ig重鏈和輕鏈的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，重鏈和輕鏈靠近N端的約110個氨基酸序列變化很大，其他部分氨基酸序列相對恒定。因此，將Ig輕鏈和重鏈中靠近N端氨基酸序列變化較大的區(qū)域稱為可變區(qū)(variable region, V區(qū))，占重鏈1/4，占輕鏈1/2；將靠近C端的氨基酸序列相對穩(wěn)定的區(qū)域，稱為恒定區(qū)(constant region, C區(qū))，占重鏈3/4，占輕鏈1/2。
1．可變區(qū) 重鏈和輕鏈的V區(qū)分別稱為VH和VL。VH和VL中各含有3個氨基酸組成和排列順序高度可變的區(qū)域，稱為高變區(qū)(hypervariable region, HVR)或互補決定區(qū)(complementarity determining region, CDR), 包括HVR1(CDR1)、HVR2(CDR2) 和HVR3(CDR3)，其中，HVR3(CDR3)變化程度更高。VH的3個高變區(qū)分別位于29～31、49～58和95～102位氨基酸，而VL的3個高變區(qū)分別位于28～35、49～56和91～98位氨基酸。VH和VL的3個CDR共同組成Ig的抗原結合部位(antigen binding site)，決定抗體的特異性，是抗體識別及結合抗原的部位。
2．恒定區(qū) 重鏈和輕鏈的C區(qū)分別稱為CH和CL。不同型(κ或λ)Ig的CL長度基本一致，但是不同類Ig的CH長度不同，例如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3, 而IgM和IgE則包括CHl、CH2、CH3和CH4。
（三）鉸鏈區(qū)
鉸鏈區(qū)(hinge region)位于CH1與CH2之間，富含脯氨酸，易伸展彎曲，從而改變抗原結合部位之間的距離，有利于抗體結合位于不同位置的抗原表位。鉸鏈區(qū)易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解，產生不同的水解片段。
二、抗體的制備流程
利用生物體對抗原物質產生免疫應答并產生抗體的機制，選用特定抗原物質對機體持續(xù)刺激使其產生大量特異性抗體，之后收集純化得到針對特定抗原的特異性抗體，這一過程就是抗體制備?？贵w制備主要步驟包括：獲得理想免疫原、免疫動物、分離血清、純化抗體和抗體應用檢測，我們在此主要介紹獲得理想免疫原、抗體的克隆性和抗體純化的一些細節(jié)。
（一）獲得理想免疫原
制備抗體首先要獲得理想免疫原，通常免疫原可以是各種形式，不過理想的免疫原則需要進一步的準備。
1. 蛋白類抗原：對于天然易獲取的蛋白可以純化后直接作為免疫原；對于天然含量較少或難以提取的蛋白，可以通過基因工程重組表達的方式獲取。同時也可以選擇蛋白的特定的連續(xù)片段做多肽合成作為抗原，較短的多肽是半抗原，通常免疫原性較弱，需要進一步偶聯(lián)載體蛋白(可選KLH、BSA、OVA)才能作為免疫原。
2. 小分子化合物：化合物抗原同樣是半抗原，也需要進一步偶聯(lián)載體蛋白才能作為免疫原。為了便于偶聯(lián)載體蛋白，特定的化合物還需要進行分子改造以便能成功偶聯(lián)。
3. 病原體：滅活的病毒或細菌可以直接作為免疫原。
免疫應答過程
1. 抗原進入機體
2. 抗原刺激 B淋巴細胞，使之分化增殖成為抗體分泌漿細胞和記憶細胞（初次免疫應答）
3. 抗體主要由漿細胞分泌
4. 記憶細胞再次受到特異性抗原刺激后會被激活而成為分泌抗體的漿細胞（再次免疫應答）
5. 記憶B細胞是長命細胞，可以存活數(shù)月甚至機體終生
抗原
是一類在適合條件下能激發(fā)機體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答，并能與免疫應答產生的效應物質（抗體和效應細胞）在體內或體外發(fā)生特異性結合反應的物質。
抗原具有兩種性能：
? 免疫原性( immunogenicity) : 指抗原分子具有誘導機體產生免疫應答的特性。
? 反應原性( reactogenicity) : 指抗原分子與抗體或效應 T 細胞等免疫應答產物發(fā)生特異性反應的特性。
抗原決定簇(antigenic determinant)
指抗原上那部分可以引起機體產生抗體的具有特殊立體構型和免疫活性的分子結構和化學基團，叫做抗原決定簇。由于抗原決定簇通常位于抗原分子表面，因而又被稱為表位(epitope)。
抗原決定簇決定著抗原的特異性，即決定著抗原與抗體發(fā)生特異結合的能力?？乖瓫Q定簇多位于蛋白質的表面，一個蛋白質大分子常有許多抗原決定簇?？乖瓫Q定簇依賴于氨基酸序列和空間構象兩種因素，又分為線性決定簇(Linear determinants)、構象決定簇(conformational determinants)和新生抗原決定簇(Neoantigenic determinant)。
?線性決定簇(Linear determinants): 又稱為順序決定簇(sequential determinants) 或連續(xù)決定簇(continuous determinants)，是抗原中直接由分子基團的一級結構序列構成的決定簇。
?構象決定簇(conformational determinants): 又稱為不連續(xù)決定簇(discontinuous determinants)，是抗原中由分子基團間特定的空間構象構成的決定簇，一般是由分子中不連續(xù)的若干肽鏈盤繞折疊而構成。
? 新生抗原決定簇(Neoantigenic determinants): 通常是由于蛋白酶的切割活化以后才會出現(xiàn)的抗原決定簇，尤其是與一些蛋白和酶（如Caspase、insulin等）的加工和活化形式對應。
（二）抗體的克隆性(Clonity)
一個抗原上可以有好幾個不同的抗原決定簇，因而使機體產生好幾種不同的抗體，最終產生出抗體是漿細胞。只針對一個抗原決定簇起作用的B細胞群或漿細胞群就是一個純系，純系的英文為Clone，音譯就是克隆。由一種B細胞群或漿細胞克隆產生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標明確地與單一的特異抗原決定簇結合，就象導彈精確地命中目標一樣。另一方面，即使是同一種抗原刺激機體，也存在多種抗原決定簇，相應地就產生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體。
單克隆抗體和多克隆抗體產生區(qū)別示意圖
（三）抗體的純化
我們知道，一般免疫血清中含有特異性抗體和非特異性抗體，血清蛋白以及其他各種雜蛋白等，在制備特異性抗體過程中當抗體的效價達到實驗預期之后，需要對免疫血清進行純化提取得到效價更高，特異性更強，穩(wěn)定性更好的抗體。
目前，大多數(shù)商品化抗體使用Protein A或Protein G進行純化。由于protein A或protein G 可以和抗體IgG分子的Fc段特異性結合。Protein A或protein G 作為配基可以被偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠上，當抗血清從中流過時，特異性的IgG就與配基結合，其他雜蛋白則穿流而過。因兩種蛋白純化抗體時對不同宿主的抗體的結合能力不同，我們需要具體情況，分別選擇protein A 或protein G, 或者是protein A/protein G組合。一般兔抗（包括單克隆蛋白與多克隆抗體）、小鼠單抗IgG2a、IgG2b、IgG3, 選擇用protein A純化；而小鼠、大鼠和山羊的多克隆抗體、小鼠單抗IgG1、大鼠單抗，則選擇用protein G純化。
