一、蛋白免疫印跡(Western Blot)技術(shù)概覽
蛋白免疫印跡(Western Blot，以下簡稱WB)是利用特定抗體能夠?qū)Ｒ唤Y(jié)合其抗原“蛋白質(zhì)”的原理來對樣品進(jìn)行著色，通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)或修飾水平的免疫檢測技術(shù)。
一般我們使用WB 都是為了半定量檢測某種目的蛋白的相對表達(dá)量，通常要以表達(dá)相對穩(wěn)定的蛋白作為內(nèi)部對照（內(nèi)參），然后采用“灰度分析軟件”檢測目的蛋白及內(nèi)參條帶的表達(dá)強(qiáng)度，每組目的蛋白分別以內(nèi)參作為對照進(jìn)行比對和相對定量，以使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。同時(shí)，同一批樣品至少進(jìn)行技術(shù)重復(fù)三次，然后方可進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。WB靈敏度可達(dá)ng級(jí)，用ECL顯色法理論上可達(dá)pg級(jí)。
二、蛋白免疫印跡(WB)實(shí)驗(yàn)所需儀器、材料及試劑
（一）主要實(shí)驗(yàn)儀器
制冰機(jī)、超聲破碎儀、低溫冷凍離心機(jī)、蛋白電泳/轉(zhuǎn)膜儀、多功能酶標(biāo)儀、LI-COR Odyssey成像系統(tǒng)
（二）主要實(shí)驗(yàn)試劑與材料
15ml離心管、玻璃組織研磨器、EP管、冰浴、蛋白抽提試劑(改進(jìn)型RIPA配方，Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C05-01001)、蛋白酶抑制劑混合物(protease inhibitor cocktail)、BCA蛋白定量試劑盒(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C05-02001)、30%丙烯酰胺-N ,N-亞甲基雙丙烯酰胺混合液(29:1)(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C05-03004)、10%過硫酸銨(APS)(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C05-03009)、四甲基乙二胺(TEMED)(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C05-03008)、4×蛋白上樣緩沖液(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C05-03015)、蛋白Marker(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C05-090006)、電泳緩沖液(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C05-03010)、轉(zhuǎn)膜緩沖液(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C05-05003)、考馬斯亮藍(lán)染色液(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C05-04001)、TBST緩沖液(pH7.4)(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C5049)、PVDF膜(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C55008)或NC膜(0.22μm)(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C05-05002)、麗春紅染色液(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C05-04002)、脫脂奶粉(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C5059)、牛血清白蛋白(BSA)、目的蛋白一抗、WB一抗稀釋液(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C05-07001)、HRP標(biāo)記二抗(bs-0295G-HRP或bs-0296G-HRP)或熒光標(biāo)記二抗(Bioss內(nèi)部操作流程選用熒光二抗，Bioss產(chǎn)品貨號(hào)bs-40295G-IRDye8或bs-40296G-IRDye8)、WB二抗稀釋液(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C05-07002)、ECL發(fā)光液(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C05-07004)、膜再生液(Bioss產(chǎn)品貨號(hào)C05-03041)
Western Blot操作流程圖及Bioss相關(guān)配套試劑
三、蛋白免疫印跡(WB)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作流程和技術(shù)要點(diǎn)
（一）蛋白提取
● 組織樣品蛋白提取方法
1. 用滅菌（預(yù)冷）的工具分離新鮮目的組織50mg-100mg，并用生理鹽水或PBS洗滌干凈，用潔凈的剪刀將組織剪碎至合適大小。
2. 將剪碎的組織轉(zhuǎn)移到玻璃研磨器中，加入適量的含有蛋白酶抑制劑（必要時(shí)還需要加入磷酸酶抑制劑）的RIPA（按照每20mg組織加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液），置于冰上研磨2-5min，直到看不到明顯的大的細(xì)胞團(tuán)塊，然后在冰浴裂解30min，讓組織細(xì)胞充分裂解；可取少量裂解后組織液滴于載玻片，蓋上蓋玻片進(jìn)行光鏡下觀察確認(rèn)是否裂解充分。
3. 注：RIPA裂解液有（中）和（強(qiáng)）裂解強(qiáng)度兩種，可以根據(jù)組織類型進(jìn)行調(diào)整，以提高裂解效率。
4. 超聲處理 10–15s，以完成細(xì)胞裂解并剪切 DNA，以降低樣品粘度和提升蛋白溶解度。
注意：為確保組織細(xì)胞充分裂解，建議進(jìn)行超聲破碎。調(diào)節(jié)超聲儀至適宜頻率與功率（超聲功率不宜過大，并設(shè)置超聲間歇，以防止超聲探頭過度產(chǎn)熱），將超聲探頭置于樣本裂解液中部，但不觸碰管壁或管底，進(jìn)行冰浴超聲。
超聲循環(huán)設(shè)置如下：
超聲3s，暫停10s，重復(fù)3-5次。
5. 超聲處理后將樣品繼續(xù)置于冰上孵育30min。
6. 將上述裂解后樣品，于4℃，12 000rpm，離心15-20min，取上清到一個(gè)新的EP管，置于冰上備用。
● 細(xì)胞樣品蛋白提取方法
1. 對于貼壁細(xì)胞：從培養(yǎng)物中吸出培養(yǎng)基，用 1× PBS 洗滌細(xì)胞后，加入含有蛋白酶抑制劑（必要時(shí)還要加入磷酸酶抑制劑）的RIPA裂解液（6 孔板每孔 100 μl 或 10 cm 直徑的平板 500 μl）來裂解細(xì)胞，然后立即從板上刮下細(xì)胞并將提取物轉(zhuǎn)移至EP管，置于冰上。
2. 對于懸浮細(xì)胞：將懸浮細(xì)胞連同培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管，室溫1000rpm離心5min，收集細(xì)胞沉淀，然后加入含有蛋白酶抑制劑（必要時(shí)還要加入磷酸酶抑制劑）的RIPA裂解液(6 孔板每孔100 μl 或 10 cm 直徑的平板 500 μl)，用加樣器吸打幾次后轉(zhuǎn)入一個(gè)新的EP管，置于冰上來裂解細(xì)胞。
3. 超聲處理 10–15s，以完成細(xì)胞裂解并剪切 DNA，以降低樣品粘度和提升蛋白溶解度。
注意：為確保組織細(xì)胞充分裂解，建議進(jìn)行超聲破碎。調(diào)節(jié)超聲儀至適宜頻率與功率（超聲功率不宜過大，并設(shè)置超聲間歇，以防止超聲探頭過度產(chǎn)熱），將超聲探頭置于樣本裂解液中部，但不觸碰管壁或管底，進(jìn)行冰浴超聲。
超聲循環(huán)設(shè)置如下：
超聲3s，暫停10s，重復(fù)3-5次。
4. 超聲處理后將樣品繼續(xù)置于冰上孵育30min。
5. 將上述裂解后樣品，于4℃，12 000rpm，離心15-20min，取上清到一個(gè)新的EP管，置于冰上備用。
（二）蛋白定量
1. 配制工作液: 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按體積比 A : B (50 : 1)配制適量 BCA 工作液，充分混勻。BCA 工作液室溫 24 小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取 10 微升標(biāo)準(zhǔn)品用 PBS 稀釋至 100ul（標(biāo)準(zhǔn)品一般可用 PBS 稀釋），使終濃度為 0.5mg/ml。將標(biāo)準(zhǔn)品按 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20ul 加到 96 孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加 PBS 補(bǔ)足到 20ul。
3. 將稀釋后（一般稀釋5倍）的適當(dāng)體積樣品加入96 孔板的樣品孔中，補(bǔ)加 PBS 到 20ul。
4. 各孔加入 200ul BCA 工作液，37℃放置 30 分鐘。
5. 將96孔板冷卻到室溫，用酶標(biāo)儀 562nm 測定 OD 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度，理想的蛋白濃度應(yīng)為1-5 μg/μl。
注意：對于過高的樣品濃度，我們建議將樣品用RIPA裂解液進(jìn)行合理稀釋并充分混勻后，再進(jìn)行一次濃度測定為宜。
（三）電泳上樣樣品的制備
1. 在上樣前，建議用提取樣品用的RIPA裂解液將制備的組織、細(xì)胞蛋白樣品的濃度統(tǒng)一調(diào)整為相同濃度并充分混勻，最好都在3-5μg/μl。
2. 上樣量為20-40μg(如果是純蛋白，上樣量為100ng)，根據(jù)上樣量計(jì)算好體積，每管樣品分別與4×蛋白上樣緩沖液按體積比1:3混勻。
3. 煮沸5-10min，使樣品還原變性，然后立即放于冰上備用。
4. 對于剩余的樣品，可以統(tǒng)一加入4×蛋白上樣緩沖液后，將樣品在-20℃或-80℃保存。
（四）電泳
1. SDS-PAGE凝膠的制備
根據(jù)要檢測的目的蛋白分子量范圍，參考下表選擇合適的分離膠濃度灌制分離膠，加入保護(hù)層（可小心加入0.5ml去離子水封壓膠面）。待分離膠凝固后，倒出保護(hù)層的去離子水，再灌注濃縮膠。根據(jù)樣品數(shù)量和體積，選擇合適的梳子插入濃縮膠。待濃縮膠完全凝固后，小心拔出梳子，將凝膠放入電泳槽內(nèi)。
2. 蛋白上樣與電泳
將上述變性處理后的樣品低速短暫離心后，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的上樣順序，分別加入樣品孔中。最后，加入合適的預(yù)染蛋白Marker。濃縮膠恒壓80V，分離膠150V電壓條件下電泳，直至指示劑溴酚蘭遷移至凝膠底部。
電泳合格標(biāo)準(zhǔn)：目的蛋白條帶位于分離膠的中部，并且條帶充分分離。
（五）考馬斯亮藍(lán)染色（備選步驟）
在進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)前，對于剛剛制備的蛋白樣品，可取少量上樣電泳后，把整張膠用考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行初步鑒定，以確定樣品的質(zhì)量。然后，再進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)。
（六）蛋白轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)法）
原理：蛋白因結(jié)合SDS而帶負(fù)電荷，在電場中從膠轉(zhuǎn)移至膜上。
1. 將PVDF膜在無水甲醇中浸泡1-3min，再孵育于冰冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中5min。膠也可以在轉(zhuǎn)膜液中平衡3-5min，防止轉(zhuǎn)膜時(shí)條帶變形。
2. 制作轉(zhuǎn)膜“三明治”
濕式轉(zhuǎn)膜三明治排列順序：海綿/吸水紙/膠/膜/吸水紙/海綿，全部緊密排列，特別是膠與膜之間不能留有氣泡
三明治安裝的方向：負(fù)極與膠同側(cè)，向正極方（膜）遷移。
膜的面積：5.2 * 8.4 cm
濾紙的面積：4條邊均略長于膜的4條邊。，
3. 200-300mA恒流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間可參考下表。
（七）轉(zhuǎn)膜后蛋白染色（備選步驟）
將膜置于麗春紅工作液中，在室溫下?lián)u動(dòng)1-5min，待蛋白帶顯示，后用TBST或超純水洗膜，直至洗凈膜上麗春紅。
（八）膜的封閉
封閉的作用：為避免作為檢測試劑的特異性一抗與膜發(fā)生非特異性結(jié)合而造成背景提高，需要對膜上的潛在非特異性結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉處理。
封閉條件：用TBST溶解的5%的脫脂奶粉或5%的BSA（建議提前配制，使奶粉或BSA充分溶解），室溫封閉1h。
另外，需注意膜封閉的一些特殊情況：
● 脫脂奶粉成本低，但不能用于磷酸化蛋白檢測。因?yàn)槊撝谭酆欣业鞍?，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白，使用脫脂奶粉時(shí)，磷酸化抗體可能也會(huì)與奶粉中的磷酸化蛋白結(jié)合，從而產(chǎn)生高背景。
● 如果是生物素標(biāo)記的二抗就不宜用牛奶，因?yàn)榕Ｄ讨泻猩锼?，?/span>BSA效果更好。
● 某些抗體用BSA封閉時(shí)因不明原因也可能會(huì)產(chǎn)生比脫脂奶粉更強(qiáng)的信號(hào)，建議參照抗體說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
（九）一抗的孵育
1. 用WB專用一抗稀釋液(對整張膜建議使用5-10ml)，按一定比例(一般為1:1000-1:2000)稀釋一抗。
2. 倒掉封閉液，將膜置于適量一抗孵育液中，4℃，水平搖床孵育過夜。
3. 用TBST洗膜，3次，每次5min。
（十）二抗的孵育和洗膜
1. 用WB二抗稀釋液按一定比例(HRP標(biāo)記二抗稀釋1:5000-1:10 000；熒光二抗1:10000-1:20000)稀釋二抗。
2. 將膜置于二抗孵育液中，水平搖床室溫孵育1h。
3. 用TBST洗膜，3次，每次5min。
（十一）目的蛋白質(zhì)顯影
● 化學(xué)發(fā)光法（使用HRP偶聯(lián)的二抗）
1. 制備 ECL 工作液：A 液和 B 液等體積的混合，例如0.5ml A 液和0.5ml B 液混合，混勻后即可使用。
2. 用量以充分覆蓋印跡膜為準(zhǔn)，每10cm2 膜需要大約 1 ml 工作液。
3. 將印跡膜有蛋白的一面朝上平整的鋪在一張平板上，加上配好的發(fā)光底物工作液。
4. 將工作液均勻滴加在印跡膜上，孵育 1-5 min。可將一潔凈的保鮮膜或透明的玻璃紙平整的鋪在孵育有工作液的印跡膜上，輕輕趕出其間的氣泡。
5. 用合適的照相器材直接記錄蛋白膜的化學(xué)發(fā)光圖或使用 X 射線膠片曝光（曝光 5 秒至 1 分鐘，通過調(diào)整 X 片的曝光時(shí)間獲得最佳結(jié)果）。
● 熒光底物法（使用熒光二抗）
1. 將膜上多余的 TBST 瀝干，可使其干燥。
2. 使用合適的熒光掃描儀(如LI-COR Odyssey 熒光成像系統(tǒng))，根據(jù)制造商的建議掃描膜上條帶。
四、蛋白免疫印跡(WB)實(shí)驗(yàn)常見問題和解決方案
附表1：Bioss常見內(nèi)參抗體
附表2：Bioss常見蛋白免疫印跡(WB)配套試劑
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