文章信息
期刊：American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine
影響因子(IF)：16.494
文章名稱(chēng)：Is PKM2 Phosphorylation Prerequisite for Oligomer Disassembly in Pulmonary Arterial Hypertension?
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作者：Novoyatleva T等
作者單位：德國(guó)吉森大學(xué)
研究背景
肺動(dòng)脈高壓（PAH）是一種不可治愈的血管疾病，由于肺部血管重構(gòu)以及肺部血管阻力增加，最終導(dǎo)致右心衰竭甚至死亡（1）。PAH與癌癥的主要病理生理機(jī)制相同，包括大量的代謝重編程，使用糖酵解途徑取代線粒體的氧化磷酸化獲取能量（WarBurg效應(yīng)）。丙酮酸激酶（PK）負(fù)責(zé)催化糖酵解途徑的最后一步反應(yīng)，即將磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）上的磷酸根轉(zhuǎn)移到ADP上，從而產(chǎn)生丙酮酸（Pyruvate）和ATP。肌肉型丙酮酸激酶基因（PKM）選擇性剪接產(chǎn)生PKM1和PKM2兩種同工酶，PKM1在分化終末組織中產(chǎn)生組成型活性四聚體，PKM2在增殖細(xì)胞和腫瘤中形成高活性的四聚體以及低活性二聚體/單體（2）。多種變構(gòu)效應(yīng)物（如fructose-1,6-bisphosphate）及翻譯后修飾（Y105 及 S37的磷酸化）控制PKM2構(gòu)象變化來(lái)變實(shí)現(xiàn)單體、二聚體和四聚體的動(dòng)態(tài)平衡。PKM2從四聚體轉(zhuǎn)變成低活性二聚體/單體，最終將糖酵解途徑轉(zhuǎn)向生物合成途徑中，促進(jìn)Warburg效應(yīng)。因此，PKM2低聚反應(yīng)是決定酶的最終活性的關(guān)鍵因素，造成代謝重編程。Erk1/2（由生長(zhǎng)因子激活）依賴型磷酸化導(dǎo)致PKM2核轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)而激活代謝基因的轉(zhuǎn)錄活性（3）。此外，核PKM2作為異鏈菌素（β-catenin）的共活化劑誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白D1和c-myc（Cyclin D1和c-Myc）表達(dá)，突出PKM2對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的非代謝作用（4）。聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）信號(hào)通路調(diào)節(jié)核PKM2功能，在PAH發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用（5，6）。
各種癌癥類(lèi)型的血漿中二聚體PKM2含量均有提高（2），表明PKM2可作為代表細(xì)胞代謝活性和增殖能力的非器官特異性生物標(biāo)記物。此外，最近的研究表明，在肺動(dòng)脈高壓(PH)內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中，PKM2的代謝和增殖異常（7，8）。PH中PKM2的血漿水平及PAH中PKM2的表達(dá)、定位、磷酸化以及寡聚化程度在很大程度上仍然是未知的。
研究結(jié)果
為了研究循環(huán)PKM2是否是PH的標(biāo)志物，作者分析了從Giessen肺高血壓登記處獲得的多種病因的患者血漿。（ethics approval no. 186/16,266/11）（9）。來(lái)自健康志愿者的外周血漿和來(lái)自平均肺動(dòng)脈壓力<25mmHg（非PH）個(gè)體的中心靜脈血漿作為非PH對(duì)照。與健康對(duì)照（n=30）、非PH對(duì)照（n=31）和慢性血栓栓塞PH患者（IV組PH；n=38）相比，血漿中二聚體PKM2的水平在特發(fā)性PAH（IPAH；n=35）患者中顯著降低（圖1A）。受試者工作特征（ROC）分析以PKM2區(qū)分IPAH患者與非PH對(duì)照的可行性，結(jié)果顯示血漿PKM2與血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)、患者患病的嚴(yán)重程度和生存并無(wú)關(guān)聯(lián)性。
圖1. PH中PKM2的血漿水平、表達(dá)以及定位。 A、采用Tu-M2PK ELISA試劑盒測(cè)定健康志愿者外周血靜脈血和非PH值對(duì)照組和PH值患者中心靜脈血（右心導(dǎo)管術(shù)）中的PKM2水平。ROC曲線下面積為0.69。95%置信區(qū)間為0.56-0.81；P < 0.01。B、定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)分析IPAH患者（n=9）與非PH對(duì)照組（n=5） PASMCs中PKM1和PKM2的mRNA表達(dá)。C、免疫組織化學(xué)和光學(xué)顯微鏡定量IPAH患者（n=12）和非PH對(duì)照組（n=11）肺組織中的PKM2。標(biāo)尺為50um。D、免疫熒光檢測(cè)非PAH（非PH）志愿者或IPAH患者（每組3個(gè)受試者）肺部小肺動(dòng)脈中PKM2（綠色）和SMA（紅色）（α-actin, 平滑肌細(xì)胞的特定標(biāo)志）。細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）染色。標(biāo)尺：50μm。CTEPH：慢性血栓性肺動(dòng)脈高壓；DAPI：4 6-diamidino-2-phenylindole；HPRT：[醫(yī)]次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶；IPAH：特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓；n.s.：不重要的；PKM2：丙酮酸激酶2；SMA：α-smooth肌肉肌動(dòng)蛋白。
圖2. PKM2的磷酸化、低聚化和調(diào)節(jié)。A、WB檢測(cè)及定量分析PASMCs（非PH對(duì)照組，n=5；IPAH患者，n=8）中 phospho-PKM2和總PKM2。B、免疫熒光檢測(cè)及定量分析PASMCs中p-PKM2的免疫熒光染色和定量（phospho-PKM2[Tyr105]抗體，bs-3334R，Bioss）。C、WB檢測(cè)及定量分析非PH對(duì)照組（n=4）及IPAH患者（n=4）肺組織及PASMCs中PKM2寡聚化（在戊二醛[0.01%]交聯(lián)后）。D，WB檢測(cè)非PH對(duì)照組及IPAH患者細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中phospho-PKM2和總PKM2（phospho-PKM2[TYR105]抗體bs-3334R，Bioss）。Lamin B1和α-tubulin分別作為細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)參蛋白。E.WB檢測(cè)及定量分析來(lái)自非PH對(duì)照組志愿者PASMCs（暴露在缺氧環(huán)境和PDGF-BB24小時(shí)后）細(xì)胞核中phospho-PKM2和總PKM2水平。F.核p-PKM2與CyclinE和PCNA的相關(guān)性分別為r=0.97，r=0.96，*P<0.05。在逐漸增加FBS含量培養(yǎng)條件下非PH對(duì)照組志愿者PASMCs細(xì)胞核中p-PKM 2，總PKM 2，Cyclin E和PCNA的WB檢測(cè)。G.通過(guò)免疫熒光定量檢測(cè) Ki67陽(yáng)性確定細(xì)胞增殖潛能，結(jié)果顯示IPAH患者肺組織PASMCs增殖潛能與四聚體比率無(wú)顯著相關(guān)性（r=-0.48）。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ki67抗體和肌動(dòng)蛋白（SMA）α（α-actin，一種平滑肌細(xì)胞的特定標(biāo)記物）。人PASMCs（傳代5～7）在37℃培養(yǎng)24h至80％。用于刺激研究的細(xì)胞用60mm培養(yǎng)皿（2×105/皿）中培養(yǎng)，用于低聚反應(yīng)的細(xì)胞用100mm培養(yǎng)皿（4×105/皿）。 每個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)胞）。PDGF-BB和FBS刺激前，細(xì)胞先用血清饑餓法培養(yǎng)24小時(shí)。缺氧環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)在37℃缺氧環(huán)境（5％CO2和1％O2）。
作者為了了解PKM2水平升高的潛在機(jī)制，將非PH對(duì)照組的PASMCs暴露于缺氧環(huán)境和血小板衍生生長(zhǎng)因子BB（PDGF-BB），這兩種環(huán)境均可觸發(fā)PASMCs細(xì)胞增殖異常。缺氧環(huán)境和PDGF-BB均顯著提高PKM2 Y 105位點(diǎn)的磷酸化，而PDGF-BB進(jìn)一步提高了核PKM2的絕對(duì)水平（圖2E）。核PKM2磷酸化水平高低與細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換的核標(biāo)記物之間存在線性依賴性關(guān)系，PKM2升高與細(xì)胞增殖呈正相關(guān)（圖2F）。PAH患者SMCs的增殖潛能與PKM2低聚化存在明顯但非顯著相關(guān)性（圖2G）。PH研究中并沒(méi)有涉及過(guò)PKM2的低聚化或磷酸化狀態(tài)，本文關(guān)于PH內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中通過(guò)促進(jìn)四聚體形成激活PKM2激活劑，逆轉(zhuǎn)糖酵解表型特征并減少不同的生物合成途徑的研究結(jié)果補(bǔ)充了這一空缺。磷酸化水平?jīng)Q定PKM2從高活性四聚體（葡萄糖氧化的重要因素）向低活性二聚體/單體（促進(jìn)糖酵解）的轉(zhuǎn)變。因此，可通過(guò)磷酸化水平依賴型的PKM2表型變化來(lái)降低PH患者肺中PK活性。IPAH患者細(xì)胞中PKM2核轉(zhuǎn)錄并不能排除有其他可降低血漿PKM2水平的調(diào)節(jié)機(jī)制存在的可能性。因此，PAH中的代謝重編程不僅僅是由PKM2含量的絕對(duì)升高引起，還由其變構(gòu)調(diào)節(jié)以及隨后的核定位引起（部分受磷酸化水平影響） 。然而，在PAH中，哪些起決定因素的分子/機(jī)制是導(dǎo)致PKM2二聚體分解為單體的生理機(jī)制，目前尚不清楚。
Bioss被引用產(chǎn)品
文中采用了Bioss公司的phospho-PKM2[TYR105]抗體（bs-3334R）對(duì)非PH對(duì)照組和IPAH患者細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中p-PKM2水平，以及不同處理后非PH對(duì)照組PASMCs細(xì)胞核中p-PKM2水平進(jìn)行WB檢測(cè)及定量分析，使作者順利完成了PKM2 Y105位點(diǎn)磷酸化水平改變酶的寡聚狀態(tài)，進(jìn)而影響酶的活性的驗(yàn)證。為作者進(jìn)一步佐證Y105位點(diǎn)磷酸化可能促進(jìn)PKM2核轉(zhuǎn)錄進(jìn)而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄水平的觀點(diǎn)提供了支撐。
（感謝《Am J Respir Crit Care Med》提供素材！侵刪！）
Bioss相關(guān)抗體
