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免疫組化抗原熱修復(fù)的技術(shù)要點(diǎn)（供參考）
發(fā)表者：北京博奧森生物 發(fā)表時(shí)間：2016-2-15
1、 抗原熱修復(fù)溫度和時(shí)間的關(guān)系
我們?nèi)粘９ぷ髦兴褂玫慕M織固定液福爾馬林會(huì)引起組織蛋白內(nèi)或蛋白之間的亞甲基發(fā)生橋連，具體過(guò)程如下：
第一步基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的化合物
第二步基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的亞甲基橋
上述反應(yīng)的結(jié)果導(dǎo)致許多抗原決定簇被封閉，而加熱可以水解該橋連使抗原被激活。影響抗原熱修復(fù)的兩個(gè)最關(guān)鍵的因素是溫度和時(shí)間，有人將這兩種因素對(duì)抗原修復(fù)的影響總結(jié)為下面的公式：
抗原熱修復(fù)的有效性=加熱溫度（T） × 加熱時(shí)間（t）
也就是說(shuō)當(dāng)我們修復(fù)時(shí)的溫度越低則需要修復(fù)的時(shí)間就越長(zhǎng)；反過(guò)來(lái)當(dāng)修復(fù)溫度增高時(shí)修復(fù)的時(shí)間可以適當(dāng)?shù)乜s短，才能使抗原決定簇完全暴露，這種反比的關(guān)系從抗體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1中也可以清楚地看出。
時(shí)間和溫度對(duì)染色的影響
時(shí)間（分鐘）
100℃ 80℃ 60℃
10 + + + ― ―
30 + + + + + + + ―
50 ― + + + + +
10小時(shí) ― ― + +
如果修復(fù)強(qiáng)度不夠，免疫組織化學(xué)染色所顯示的只能是修復(fù)后暴露的部分抗原決定簇，而不是組織所含的全部抗原。這樣的染色結(jié)果可能會(huì)非常弱，或出現(xiàn)假陰性，即使是陽(yáng)性結(jié)果，充其量只能起到定性的作用，不能適應(yīng)今后對(duì)免疫組化進(jìn)行定量的需要。這就給我們?cè)\斷中定量指標(biāo)的應(yīng)用帶來(lái)困難，例如用來(lái)測(cè)定耐藥的指標(biāo)。
2、 組織固定時(shí)間和所需的抗原熱修復(fù)的關(guān)系
大量的實(shí)驗(yàn)表明，固定時(shí)間越長(zhǎng)的標(biāo)本，它所形成的橋連就越緊密，抗原就越難以被激活，所需要的修復(fù)強(qiáng)度也就越強(qiáng)。有意思的是隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)，組織中蛋白對(duì)溫度的耐受也相應(yīng)增高（如圖1所示），這可能就是我們對(duì)固定時(shí)間長(zhǎng)的標(biāo)本加大修復(fù)強(qiáng)度的理論基礎(chǔ)。
圖一 固定時(shí)間和變性的關(guān)系
這就提醒我們?cè)谧龌仡櫺缘难芯繒r(shí)一定要注意所使用的修復(fù)條件，它與新鮮標(biāo)本的修復(fù)條件一定是有所區(qū)別的，同等條件下一定要加長(zhǎng)修復(fù)的時(shí)間或提高修復(fù)所使用的溫度，才可能得到比較滿意的結(jié)果。
3、 不同PH值抗原修復(fù)液對(duì)染色結(jié)果的影響
抗原熱修復(fù)中所使用的修復(fù)液PH值也會(huì)對(duì)染色結(jié)果產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。PH值對(duì)染色結(jié)果的影響大概可以分為以下四種情況。
A―穩(wěn)定型，PH值對(duì)染色結(jié)果影響不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等。
B―V型，高PH值和低PH值染色較好，而PH值4-5染色結(jié)果較差，如ER、Ki-67等。
C―上升型，隨著PH值的增加，染色結(jié)果逐漸增強(qiáng)，如HMB45等。
D―下降型，隨著PH值的增加染色結(jié)果逐漸減弱，當(dāng)然這種類型的抗體只是個(gè)別的現(xiàn)象，如MOC31。 一個(gè)有趣的現(xiàn)象值得注意，即在高PH值（圖中圓圈所示約PH8.0~9.0），A、B、C三者都有較好的染色結(jié)果，所以目前比較推崇的抗原修復(fù)液為高PH值得修復(fù)液，如1mMEDTA, PH8.0或PH9.0等。但是由于傳統(tǒng)習(xí)慣，絕大多數(shù)醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室都在使用PH6.0的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床工作的實(shí)際情況，許多國(guó)外免疫組化專家建議，在常規(guī)的免疫組化工作中，全部選用高PH值得修復(fù)液來(lái)代替目前廣為使用的PH6.0枸櫞酸緩沖液。為此，本公司已經(jīng)推出PH8.0和PH9.0的新型抗原修復(fù)液。經(jīng)驗(yàn)證，絕大多數(shù)的抗體使用PH9.0得修復(fù)液效果都要優(yōu)于PH6.0的枸櫞酸，尤其是核陽(yáng)性的抗體。所以，在常規(guī)的免疫組化工作中，使用高PH值的抗原修復(fù)液是今后的必然趨勢(shì)。
4、 抗原熱修復(fù)的手段
微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)的比較
溫度 壓力 v時(shí)間 受熱
微波爐 100℃ 1P 15~20分鐘 不均勻
高壓鍋 120℃ 1.2P 噴氣2分鐘 均勻
目前抗原熱修復(fù)所采用的方法主要有微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)兩種，從表中可以看出，由于高壓鍋修復(fù)具有溫度均一、節(jié)省時(shí)間、效果穩(wěn)定等特點(diǎn)，已經(jīng)越來(lái)越受到人們的青睞。
石蠟切片免疫組化染色步驟
三步法（以SP試劑盒為例）
●石蠟切片脫蠟至水。
●蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，如果采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行。
●3%H2O2室溫孵育5~10分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，PBS沖洗，2分鐘×3次。
●5~10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時(shí)或4℃過(guò)夜。
●PBS沖洗，2分鐘×3次。
●滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘。
●PBS沖洗，2分鐘×3次。
●滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘。
●PBS沖洗，2分鐘×3次。
●顯色劑顯色（DAB或AEC）。
●自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明、封片。
●如果必要，可選用avdin封閉內(nèi)源性生物素。
冰凍切片的免疫組化染色步驟
●速凍組織
●冰凍切片4~8μm，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲(chǔ)存低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后儲(chǔ)存于-20℃冰箱。
●室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘。也可根據(jù)需要選擇其他的固定方式。
●PBS沖洗，5分鐘×3次。
●用3%過(guò)氧化氫孵育5~10分鐘，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。
●PBS沖洗，5分鐘×3次。
●下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟（滴加一抗開(kāi)始）。
