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抗體標(biāo)記是指將標(biāo)記物（酶、熒光染料、生物素、膠體金等）以共價(jià)結(jié)合或物理吸附的方式與抗體進(jìn)行連接，形成抗體-標(biāo)記物復(fù)合物；在抗體-標(biāo)記物復(fù)合物與待檢物形成特異性多元復(fù)合物后，通過熒光顯微鏡、射線測(cè)量?jī)x、酶標(biāo)檢測(cè)儀、電子顯微鏡和發(fā)光免疫測(cè)定儀等精密儀器對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)等不同水平上對(duì)抗原、抗體反應(yīng)的定性及定位研究，或者應(yīng)用各種免疫分析方法對(duì)體液中的半抗原、抗原進(jìn)行定性和定量測(cè)定。目前抗體標(biāo)記技術(shù)己被廣泛用于醫(yī)學(xué)病理學(xué)、免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)、生物制藥等領(lǐng)域的分析研究與技術(shù)測(cè)定。下面簡(jiǎn)要介紹幾種常見的抗體標(biāo)記方法：
一、酶標(biāo)記
以共價(jià)鍵結(jié)合的方式將酶聯(lián)結(jié)在抗體上，得到酶標(biāo)抗體復(fù)合物，之后借助酶對(duì)底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，這些有色產(chǎn)物可用肉眼、顯微鏡、分光光度計(jì)等進(jìn)行觀察或測(cè)定，從而證明發(fā)生了相應(yīng)的免疫反應(yīng)。在生命科學(xué)的科學(xué)研究過程中，最常用的抗體標(biāo)記酶包含辣根過氧化物酶 (HRP)和堿性磷酸酶 (AP)。
1、辣根過氧化物酶標(biāo)記辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體一般采用過碘酸鈉法。過碘酸鈉法的原理是通過過碘酸鈉將HRP的糖基氧化成醛基，該醛基可與抗體IgG上的氨基進(jìn)行結(jié)合，形成Schiff氏堿。
2、堿性磷酸酶標(biāo)記堿性磷酸酶標(biāo)記抗體時(shí)最常用的是戊二醛一步法。在標(biāo)記時(shí)，先將堿性磷酸酶與單抗混合，之后加入適量的戊二醛，使堿性磷酸酶和抗體蛋白的氨基分別與兩個(gè)醛基結(jié)合，進(jìn)而形成結(jié)合物。
二、熒光染料標(biāo)記
熒光標(biāo)記技術(shù)是指將能發(fā)射熒光的標(biāo)記物通過共價(jià)結(jié)合或物理吸附等方式標(biāo)記于目標(biāo)分子的某個(gè)基團(tuán)上，從而利用標(biāo)記物的熒光特性來反映研究對(duì)象的信息。常見的熒光染料包含小分子熒光染料、時(shí)間分辨熒光材料、上轉(zhuǎn)化發(fā)光材料、量子點(diǎn)熒光材料等。
1、小分子熒光染料目前，關(guān)于小分子熒光染料的報(bào)道中，常用到的熒光基團(tuán)多為芳香族的化合物，在抗體標(biāo)記過程中常用到的小分子染料包含以下幾類：
(1)熒光素類 (如FITC)：異硫氰酸熒光素 (FITC)是目前應(yīng)用最為廣泛的一種熒光素衍生物，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC標(biāo)記抗體是基于FITC 的異硫氰基在堿性條件下能與IgG的自由氨基結(jié)合，進(jìn)而形成IgG與熒光素的結(jié)合物。
(2)羅丹明類：是以氧雜蒽為母體的堿性呫噸染料，是生物醫(yī)學(xué)中常用的一類熒光染料，一般通過與被標(biāo)記物的氨基結(jié)合實(shí)現(xiàn)標(biāo)記。
(3)花菁類熒光染料 (如Cy系列染料)：菁染料在光照下不穩(wěn)定，但具有摩爾消光系數(shù)高、光譜范圍廣且光量子點(diǎn)產(chǎn)率高等特性，在使用時(shí)可通過染料的NHS與抗體的氨基連接，進(jìn)而形成結(jié)合復(fù)合物。
(4)羅丹明或香豆素等染料的衍生物 (如Alexa Fluor)：Alexa Fluor通過利用磺酸或磺酸鹽代替羅丹明或香豆素等染料中的氫原子而合成，主要通過磺酸酯活性基團(tuán)與生物分子中的伯胺相結(jié)合形成琥珀酰亞胺酯穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)、核酸等生物分子的 Alexa Fluor 熒光標(biāo)記。
(5)其他染料，如吖啶、菲啶類、查爾酮和香豆素類、稠環(huán)芳烴類、噻嗪/噁嗪類、丹磺酞胺、卟啉類等。
部分常見熒光標(biāo)記物的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)
三、生物素標(biāo)記
生物素標(biāo)記反應(yīng)常用生物素琥珀酰亞胺酯進(jìn)行。生物素是與抗體分子的游離賴氨酸等發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)而完成標(biāo)記。一般一個(gè)抗體可以標(biāo)記3-5個(gè)生物素，標(biāo)記時(shí)，生物素與抗體的比率受抗體濃度影響，對(duì)于10 mg/ml 的抗體溶液來說，生物素應(yīng)超過蛋白12倍（摩爾數(shù)），對(duì)于2 mg/ml 的抗體溶液應(yīng)超過20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。
四、膠體金標(biāo)記
膠體金標(biāo)記是利用氯金酸在還原劑作用下聚合成直徑 1~150nm的金顆粒, 形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài), 稱膠體金。
膠體金標(biāo)記就是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機(jī)理是膠體金顆粒具有高電子高密度的特性, 其表面的負(fù)電荷能與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)靜電吸附而牢固結(jié)合。
不同免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常用到的標(biāo)記物類型匯總
